Diphenylboric acid 2-aminoethyl ester thuốc thử hóa chất
|
BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHÍ THỊ BẢO THOA Mã sinh viên : 1201576 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG CAO ACTISO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 Danh mục hình ...................................................................................................... i Danh mục sơ đ ồ .................................................................................................... ii
ii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đ ồ 3 Chuẩn bị dịch chiết Lạc tiên ................................................................... 27 DANH MỤC BẢNG Bảng 2 Điều kiện sắc ký định lượng vitexin bằng HPLC .................................... 13 Bảng 3 Tóm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của dược liệu Lạc tiên (Herba Passiflorae foetidae) ........................................................................... 28 Bảng 5 So sánh tiêu chuẩn đề nghị và tiêu chuẩn DĐVN 4 ................................. 32 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, vai trò của các dược liệu thiên nhiên ngày càng được quan tâm và đề cao. Với những điều kiện tự nhiên thuận lợi, Việt Nam được thiên nhiêu ưu đãi một kho tàng dược liệu vô cùng phong phú. Trong đó, loài Passiflora foetida L. Passifloraceae, tên thường gọi là Lạc tiên, được sử dụng rộng rãi trong dân gian để làm thuốc an thần, chữa hồi hộp, lo âu, mất ngủ, đồng thời là nguồn nguyên liệu cho sản xuất đông dược và tân dược. Vì các dư ợc liệu giả, dư ợc liệu kém chất lượng xuất hiện ngày càng nhiều nên việc xây dựng một tiêu chuẩn hoàn chỉnh để kiểm nghiệm cho loại dược liệu này là hết sức cần thiết. Trong khuôn khổ một báo cáo hết môn, chúng tôi đặt vấn đề “Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Lạc tiên, (Herba Passiflorae foetidae)”, với mục đích nâng cao các tiêu chuẩn hiện có và bổ sung một số tiêu chuẩn mới cho Dược điển Việt Nam IV. Nội dung của báo cáo này bao gồm:
Hình 2 Lạc tiên (Passiflora foetida) 2.1. Phân bố, thu hái và chế biếnMọc hoang ở khắp nơi tại nước ta. Thường trẻ con vẫn hái quả ăn. Trước đây hầu như nhân dân ta không dùng cây này làm thuốc. Từ năm 1940, một dược sĩ Việt Nam từ Pháp về thấy cây này hơi giống Passiflora ở bên Pháp mà tại Pháp người ta dùng cây đó làm thuốc an thần nên đã dùng lạc tiên của ta chế thuốc an thần. Hái toàn cây trừ rễ, dùng tươi hay phơi khô, chế thuốc sắc hay pha rượu thuốc, không chế biến gì đặc biệt. [3] 2. Thành phần hóa họcThành phần hóa học của Lạc tiên bao gồm: flavonoid, alkaloid, tannin, các acid béo, ... Flavonoid: Hàm lượng flavonoid toàn phần là 0,074%, bao gồm: pachypodol; 7,4’- dimethoxyapigenin, ermanin ; 4’,7-O-dimethyl-naringenin; 3,5-dihydroxy-4,7- dimethoxy flavanone. Các C-glycosyl flavonoids : chrysoeriol, apigenin ; isovitexin; vitexin; 2’’-xylosylvitexin; luteolin-7-β-D-glucosid; kaempferol. [2],[7] Hình 2 Cấu trúc các Flavonoid trong Lạc tiên [7] Alakaloid: có hàm lượng 0%, chủ yếu là các indol alkaloid có chứa vòng β- carbolin như harman, harmol, harmine, harmalol, harmaline [2],[7] Hình 2 Cấu trúc các Alkaloid trong Lạc tiên [7] Cyanohydrin glycoside: cyclopeneten vòng, tetraphyllin A, tetraphyllin B, tetraphyllin B sulphat, deidacin và volkenin [7] 2.3 Tác dụng bảo vệ gan Flavonoid có trong lạc tiên được coi là có tác dụng bảo vệ tế bào gan. Dịch chiết cồn Lạc tiên (200 mg/kg/ngày) được chứng minh là làm giảm các chỉ số sinh hóa ALT, AST, ALP, bilirubin và γ-glutamate trasaminase do tổn thương gan gây ra bởi CCl 4 trên chuột có ý nghĩa thống kê (P < 0,001) [13] 2.3 Tác dụng kháng khuẩn Dịch chiết ethanol và aceton của lá và quả Lạc tiên (Passiflora foetida) được chứng minh là có tác dụng kháng khuẩn trên Pseudomonas putida, Vibrio cholerae, Shigela flexneri và Streptococcus pyogenes. Kết quả cũng cho thấy tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết lá lớn hơn so với dịch chiết từ quả. Dịch chiế menthanol của rễ có tác dụng kháng Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli. [13] 2.3 Tác dụng chống loét dạ dày Dịch chiết ethanol của P với liều 100-200 mg/kg được chứng minh là có tác dụng giảm loét dạ dày do ethanol và aspirin gây ra và tăng pH dạ dày trên chuột có ý nghĩa thống kê (P <0,01). 2.3 Tác dụng chống oxy hóa Vitenix được chứng minh là có tác dụng chống lão hóa và được sử dụng trong mỹ phẩm. Tác dụng chống chống oxy hóa thể hiện mạnh nhất trong dịch chiết ethanol từ lá (Sasikala et al. 2011) [13] 2. Tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp thử2.4 Mô tảĐoạn thân rỗng, dài khoảng 5 cm, mang tua cuốn và lá, có thể có lẫn hoa và quả. Thân và lá có nhiều lông. Cuống lá dài 3 - 4 cm. Phiến lá mỏng màu lục hay hơi vàng nâu, dài và rộng khoảng 7 - 10 cm, chia thành 3 thuỳ rộng, đầu nhọn. Mép lá có răng cưa nông, gốc lá hình tim. Lá kèm hình vẩy phát triển thành sợi mang lông tiết đa bào, tua cuốn ở nách lá. [5] 2.4 Vi phẫuLá: Phiến lá gồm biểu bì trên, mô giậu, mô mềm và biểu bì dưới. Biểu bì trên và dưới có lông che chở và lông tiết. Lông che chở đơn bào, nhỏ. Lông tiết có chân đa bào gồm nhiều dãy tế bào xếp thành hàng dọc, thon dần về phía ngọn, đầu đơn bào hình trứng, chứa chất tiết màu vàng. Gân chính gồm biểu bì trên và dưới, mô dầy dưới biểu bì, mô mềm và ở giữa là bó libe-gỗ. Trong libe và rải rác trong mô mềm có tinh thể calci oxalat hình cầu gai có đường kính 7 – 12 μm. [5] 2.4 BộtCó nhiều lông che chở đơn bào, lông tiết đa bào còn nguyên hay bị gãy. Mảnh biểu bì có lỗ khí kiểu hỗn bào. Mảnh mô mềm hay libe có chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Mảnh mạch xoắn, mạch vạch. [5] 2.4 Độ ẩmKhông quá 13% Cách tiến hành: Dùng dụng cụ sấy thuỷ tinh rộng miệng đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; làm khô bì trong thời gian 30 phút theo rồi cân để xác đ ịnh khối lượng bì. Cân ngay vào bì này một lượng chính xác 2-5g mẫu thử với sai số không quá 10%. Dàn mỏng thành lớp có độ dày không quá 5 mm, tiến hành sấy ở 50-60°C đến khi khối lượ ng không đổi. Sau khi sấy phải làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân ngay. Mất khối lượng do làm khô là sự giảm khối lượng của mẫu thử biểu thị bằng phần trăm (kl/kl). [5] 2.4 Định tính2.4.8 Phương pháp hóa học Lấy khoảng 20 g bột dược liệu cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml ethanol 90% (TT), lắc đều và đun hồi lưu cách thuỷ khoảng 30 phút. Lọc, lấy dịch lọc chia đều thành 3 phần và cô cách thuỷ tới cặn khô. Định tính flavonoid Thêm vào phần cắn thứ nhất 10 ml n-hexan (TT) hoặc ether dầu hoả (TT), dùng đũa thuỷ tinh khuấy kỹ rồi gạn bỏ lớp dung môi. Làm như vậy thêm một lần nữa. Hoà tan cắn còn lại trong 4 ml ethanol 90% (TT), đun nóng nhẹ cho tan. Lọc, lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm ít bột magnesi (TT) rồi thêm từ từ 0,5 ml acid hydrocloric (TT). Lắc nhẹ. Dung dịch sẽ có màu đỏ cam. [5] Định tính alkaloid Thêm vào phần cắn thứ hai 4 giọt amoni hydroxyd đậm đặc (TT) và 5 ml cloroform (TT), khuấy kỹ, lọc vào bình gạn 50 ml. Thêm vào bình gạn 4 ml dung dịch acid sulfuric 1% (TT). Lắc kỹ và gạn lớp acid vào ba ống nghiệm: Ống nghiệm 1: Thêm 1 giọt thuốc thử Mayer (TT) sẽ cho tủa màu trắng đục. Ống nghiệm 2: Thêm 1 giọt thuốc thử Bouchardat (TT) sẽ cho tủa đỏ nâu. Ống nghiệm 3: Thêm 1 giọt thuốc thử Dragendorff (TT), cho tủa vàng cam. [5] Định tính cyanohydrin glycoside Thêm vào phần cắn còn lại 3 giọt acid sulfuric, đun cách thủy. Trung hòa bằng natri hydroxid và thêm 5 ml thuốc thử Fehling. Cài giấy thử picrat lên miệng ống nghiệm sao cho giấy thử không chạm vào thành ống. Đậy nắp, đun cách thủy 15 phút, giấy thử sẽ chuyển thành màu vàng cam đến đỏ gạch. [10] 2.4.8. Phương pháp sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel F 254 Dung môi khai triển: n-butanol – acid acetic – nước (7: 1: 0,5) Dung dịch thử: Lấy khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình nón nút mài, thêm 20 ml ethanol 96% (TT), lắc đ ều, cách thủy 30 phút. Lọc, cô cách thủy đến cắn khô. Hòa cắn trong 1 ml methanol, dùng làm dung dịch thử. Dung dịch đối chiếu: lấy khoảng 5g bột dược liệu lạc tiên tiêu chuẩn, tiến hành tương tự như đối với dung dịch thử. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 μl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đ ến khi dung môi đi được khoảng 10 - 12 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun thuốc thử FeCl 3 3% /cồn, đ ể khô. Trên sắc ký đ ồ của dung dịch thử phải có các vết phát quang có cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đ ồ của dung dịch đối chiếu. [6] 2.4.8 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Bản mỏng: Silica gel 60 F 254 Dung môi khai triển: Toluen: Ethyl acetat: Methanol (7: 2: 1) Dung dịch thử: Lấy khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình soxhlet, chiết bằng 100 ml ethanol 70% trong 72 giờ, ở 70 oC. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc vào bình nón. Cô dịch lọc trên bếp cách thủy còn khoảng 20 ml, dùng làm dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: lấy khoảng 5 g bột dược liệu lạc tiên tiêu chuẩn, tiến hành tương tự như đối với dung dịch thử. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 μl mỗi dung dịch trên thành các dải dài 10 mm. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới đèn UV 366 nm. Trên sắc ký đ ồ của dung dịch thử phải có các vết phát quang có cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đ ồ của dung dịch đối chiếu. [10] Cách tiến hành: Trên bản sắc ký chấm 2 vết: Vết 1 là dung dịch thử, vết 2 là hỗn hợp các flavonoid chuẩn. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, nhúng thuốc thử diphenylboric acid-2-aminoethyl ester, để khô. Quan sát dưới đèn UV 366 nm. Trên sắc ký đ ồ của dung dịch thử phải có các vết phát quang cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đ ồ của dung dịch đối chiếu [9]
Dung môi khai triển: Chloroform: aceton: diethylamin (50:40:10) Dung dịch thử: Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình soxhlet, chiết bằng methanol với tỉ lệ 1:2. Lọc dịch chiết qua giấy lọc vào bình nón và cô trên bếp cách thủy đến cắn. Hòa tan 300 mg cắn trong 10ml methanol, dùng làm dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: lấy khoảng 10 mg harmaline hòa tan trong 10 ml methanol Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 8 μl dung dịch thử v à 7 μl dung dịch đối chiếu. Sau khi triển khai sắc ký được 10 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới đèn UV 351 nm. Trên sắc ký đ ồ của dung dịch thử phải có vết phát quang có cùng màu sắc và giá trị Rf với vết trên sắc ký đ ồ của dung dịch đối chiếu. [14] Ngoài ra, còn có thể định tính harmaline bằng sắc ký cột với đầu dò UV. [15] 2.4 Định lượng2.4.9 Phương pháp đo quang [11] Lượng flavonoid trong dược liệu tính theo vitexin không đư ợc nhỏ hơn 1,5%. Chuẩn bị dịch chiết: cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào bình cầu 100 ml và thêm 40 ml ethanol 60%. Đun hồi lưu 30 phút trên bếp cách thủy ở 60 °C. Để nguội và lọc bằng bông vào bình nón 100 ml. Tiếp tục chiết lần 2 với 40 ml ethanol 60%, đun hồi lưu trong 10 phút. Để nguội lọc dịch chiết qua giấy lọc vào bình định mức 100ml. Tráng bình cầu, bình nón và lọc vào bình định mức, thêm ethanol 60% đến vạch. Mẫu thử: thêm 5ml dịch chiết vào bình nón, bay hơi ở áp suất giảm đến cắn và hòa tan căn bằng 10 ml hỗn hợp methanol- acid acetic băng tỉ lệ 10:100. Thêm 10 ml dung dịch gồm 25 g/l acid boric và 20 g/l acid oxalic trong acid formic khan. Thêm acid aceticd khan vừa đủ 25 ml. Mẫu trắng: thêm 5ml dịch chiết vào bình nón, cho bay hơi ở áp suất giảm đến cắn và hòa tan cắn bằng 10 ml hỗn hợp methanol- acid acetic băng tỉ lệ 10:100. Thêm 10 ml acid formic khan. Thêm acid aceticd khan vừa đ ủ 25 ml. Để yên 30 phút Sau 30 phút, đo độ hấp thu của mẫu thử ở bước sóng 401 nm, so với mẫu trắng. Lượng Flavonoid toàn phần tính theo vitexin 퐴 × 0, 푚 Trong đó: A : là độ hấp thu của mẫu thử ở bước sóng 401 nm m: là khối lượng cân dược liệu tính bằng gam 2.4.9 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Chuẩn bị mẫu: cân chính xác khoảng 0, 2 g bột Lạc tiên cho vào bình nón nút mài 100 ml, thêm 25ml methanol, siêu âm 50°C trong vòng 30 phút, lọc qua giấy lọc vào bình nón nút mài 100 ml, làm tương tự 3 lần x 25 ml methanol nhưng siêu âm 15 phút. Dịch lọc được bốc hơi dưới áp suất giảm trong bình cầu loại 250 ml. Cho vào bình cầu 2,5 ml methanol, lắc đều, siêu âm cho cắn tan hết, thêm vào 40 ml nước cất, siêu âm 5 phút, cho vào bình lắng gạn, tráng bình cầu bằng 10ml nước cất rồi cho vào bình lắng gạn. Lắc, đ ể yên cho tách lớp, tách lớp cloroform, làm tương tự thêm 3 x 10 ml cloroform. Dịch nước được bốc hơi ở áp suất giảm cho đến cắn, hòa cắn với dung môi methanol- nước (50:50), cho vào bình định mức 50 ml, lọc dịch qua màng lọc micropore 0,45 μm vào lọ nhỏ để triển khai sắc ký. Điều kiện sắc ký: Bảng 2 Điều kiện sắc ký định lượng vitexin bằng HPLC Theo Huỳnh Lời (Việt Nam) Theo Narongchai Pongpan (Thái Lan) [12] Máy HPLC autosampler Thermo separation Detector PDA Dải sóng phát hiện: 210- nm Bước sóng phát hiện: 340 nm PDA Bước sóng phát hiện: 340 nm Chủ trị: suy nhược thần kinh, tim hồi hộp, mất ngủ, hay nằm mơ, phụ nữ hành kinh sớm, đau bụng do nhiệt táo, ho do phế nhiệt, phù thũng, bạch trọc. Ở Ấn Độ, Lạc tiên được dùng để trị tiêu chảy, viêm tai mũi họng, ghẻ ngứa... Ở Malaysia, Lạc tiên được dùng để trị hen suyễn. Ở Argentina, để trị động kinh [13] |
