Khử trùng vật liệu nuôi cấy bằng cách nào

Bài viết được tham vấn chuyên môn cùng ThS.BS Trần Thị Vượng - Bác sĩ Vi sinh - Khoa Xét nghiệm - Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Hải Phòng.

Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi khuẩn ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Do vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết đều phải được khử trùng trước khi sử dụng.

Nuôi cấy vi khuẩn là đưa bệnh phẩm nghi ngờ chứa vi khuẩn vào môi trường thích hợp nhằm tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển. Tùy theo mục đích mà các môi trường nuôi cấy có các chất dinh dưỡng cơ bản hay thêm các yếu tố đặc biệt [ví dụ muối, muối mật, các chất tạo màu...] để nhận biết được các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn. Từ đó giúp nhận định sơ bộ ban đầu về nhóm vi khuẩn hoặc vi khuẩn nghi ngờ gây bệnh.

Có nhiều kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn, tuy nhiên có thể phân loại như sau:

Cấy phân vùng:

• Cấy định danh: cấy trên các môi trường định danh, nhằm phát hiện các tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn. Mỗi vi khuẩn có 1 bộ tính chất sinh vật hóa học riêng. Vì vậy sau khi cấy định danh 24h, dựa vào bộ tính chất sinh vật hóa học để xác định tên vi khuẩn.
• Cấy tăng sinh: tăng sinh số lượng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm, đặc biệt với các bệnh phẩm ban đầu ít vi khuẩn như máu, dịch não tủy, dịch màng phổi...
• Cấy định lượng: nhằm xác định mật độ vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm ban đầu 1 cách khá tuyệt đối. Điển hình của phương pháp cấy định lượng là cấy nước tiểu.
• Cấy bán định lượng: nhằm xác định mật độ vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm ban đầu 1 cách tương đối. Điển hình của phương pháp cấy định lượng là cấy đờm.
• Cấy lưu chủng: cấy vi khuẩn đã định tên, đã biết tên vào môi trường thích hợp để lưu giữ chủng vi khuẩn phục vụ nghiên cứu hoặc các mục đích khác.

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn cũng rất đa dạng. Tùy theo mục đích nuôi cấy, tùy theo loại bệnh phẩm, tùy theo căn nguyên vi khuẩn để lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp. Các môi trường nuôi cấy thạch rắn như: thạch máu, thạch chocolate, thạch MacCon-key, thạch UTI phổ biến dùng với các vi khuẩn gây bệnh thường gặp. Cấy phân vùng, cấy định lượng và bán định lượng thường dùng các loại thạch này để thực hiện.

Một số thạch rắn chọn lọc cho từng nhóm, từng loại vi khuẩn như: thạch Strepto B chọn lọc Liên cầu nhóm B, thạch SS, Hektoen chọn lọc vi khuẩn salmonella, shigella...

Các vi khuẩn khó mọc, hoặc các vi khuẩn có tính chất đặc biệt thì cần các môi trường đặc biệt để ưu tiên cho vi khuẩn gây bệnh phát triển như vi khuẩn tả cần cấy trên môi trường TCBS...

Môi trường để cấy tăng sinh thường là môi trường lỏng như BHI, canh thang glucose 2%, môi trường pepton kiềm

Môi trường cấy định danh thì có thể là môi trường thạch đặc đĩa petri hoặc thạch nghiêng để tìm các tính chất sinh vatah hóa học của vi khuẩn, từ đó xác định được tên vi khuẩn.

Sau khi vi khuẩn được đưa vào các môi trường này, cần cung cấp nhiệt độ và điều kiện khí trường tốt nhất cho vi khuẩn phát triển. Hầu hết các loại vi khuẩn cần nhiệt độ 35 oC±1, khí trường bình thường là có thể phát triển. Một số vi khuẩn cần thêm CO2 trong môi trường như lậu cầu, não mô cầu ...một số cần điều kiện kỵ khí. Thiết bị thường được dùng để ủ cho vi khuẩn phát triển là tủ ấm thường hoặc tủ ấm có cung cấp CO2 5%.

Trong nội dung bài viết này, xin được đề cập đến phương pháp cấy phân vùng với các vi khuẩn thường gặp

Điều quan trọng cách nuôi vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy

Phân lập là khâu quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn.

Mục đích của phương pháp phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng vi khuẩn thuần khiết [clon] được gọi là khuẩn lạc. Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn sẽ tạo ra những khuẩn lạc. Mỗi nhóm vi khuẩn, mỗi loại vi khuẩn có hình thái tính chất khuẩn lạc đặc trưng. Người làm xét nghiệm nhận định tính chất khuẩn lạc, sẽ lựa chọn khuẩn lạc nghi ngờ đó để định danh tên vi khuẩn gây bệnh.

Cấy phân lập vi khuẩn có thể thực hiện trực tiếp với bệnh phẩm ban đầu, hoặc thực hiện với vi khuẩn đã được cấy trên môi trường thạch rắn trước đó [trong trường hợp lần cấy phân lập ban đầu chưa tách được khuẩn lạc riêng rẽ].

Điều quan trọng cấy phân lập vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Do vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết đều phải được khử trùng trước khi sử dụng.

Có những phương pháp phân lập, nuôi cấy vi khuẩn nào?

• Kỹ thuật cấy phân lập: sử dụng đĩa thạch petri để thực hiện kỹ thuật cấy phân vùng.
• Dùng que cấy vô trùng nhúng hoặc chạm vào mẫu bệnh phẩm để lấy các vi khuẩn muốn phân lập. Trường hợp cấy dịch ít vi khuẩn: dùng pipet Paster hút dịch từ ống đựng bệnh phẩm, rồi nhỏ 1-2 giọt bệnh phẩm xuống đĩa thạch petri.
• Ria que cấy vừa chạm vào bệnh phẩm thành đường zich zac trên đĩa petri có chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi đường ria liên tục, hãy đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác tiếp theo.
• Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ấm.
• Như vậy mật độ vi khuẩn sẽ giảm dần từ vùng 1 đến vùng 3. Trường hợp bệnh phẩm nhiều vi khuẩn, đến vùng 3 sẽ phân lập được vi khuẩn riêng rẽ. Mỗi vi khuẩn riêng rẽ sẽ mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ.

Ủ ấm đĩa thạch trong điều kiện thích hợp. Đọc kết quả sau 24h.

Các mẫu dịch, mủ ở vị trí vô trùng nếu mọc thường mọc 1 loại vi khuẩn, 1 loại khuẩn lạc. Người làm xét nghiệm sẽ nhận định tính chất khuẩn lạc để lựa chọn môi trường cấy định danh ra tên vi khuẩn. Trường hợp không mọc sẽ trả âm tính sau 48h.

Các mẫu bệnh phẩm ở vị trí có sự hiện diện của vi khuẩn thường trú như mũi, họng, tỵ hầu, phân, đờm thì sẽ mọc nhiều loại khuẩn lạc khác nhau. Người làm xét nghiệm sẽ lựa chọ khuẩn lạc nghi ngờ để định danh.

Tóm lại, cấy phân vùng là khâu đầu tiên và rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn. Kỹ thuật và kinh nghiệm của người làm xét nghiệm cũng đóng vai trò quan trọng trong việc đưa ra kết quả nuôi cấy vi khuẩn 1 cách chính xác.

Ngoài ra để kết quả đảm bảo chính xác và kịp thời thì việc lấy bệnh phẩm đóng vài trò tiên quyết. Lấy đúng vị trí và đúng kỹ thuật sẽ cho kết quả chính xác và kịp thời nhất!

Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec là một trong những bệnh viện không những đảm bảo chất lượng chuyên môn với đội ngũ y bác sĩ đầu ngành, hệ thống trang thiết bị công nghệ hiện đại mà còn nổi bật với dịch vụ khám, tư vấn và chữa bệnh toàn diện, chuyên nghiệp; không gian khám chữa bệnh văn minh, lịch sự, an toàn và tiệt trùng tối đa.

Để được tư vấn trực tiếp, Quý Khách vui lòng bấm số HOTLINE hoặc đăng ký lịch trực tuyến TẠI ĐÂY. Tải ứng dụng độc quyền MyVinmec để đặt lịch nhanh hơn, theo dõi lịch tiện lợi hơn!

XEM THÊM:

Nuôi cấy mô tế bào thực vật [Plant tissue culture] là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật [rễ, chồi,…] hoặc cơ thể thực vật hoàn chỉnh trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định hoặc chưa xác định.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật có rất nhiều ứng dụng khác nhau, trong đó ứng dụng nổi bật nhất và đạt được kết quả thương mại lớn nhất là nhân giống in vitro [hay còn gọi là vi nhân giống – micropropagation].

Quá trình nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô có thể bằng đầu bằng hầu hết những nguồn mẫu khác nhau: hạt, lá, hoa, quả, củ, rễ, thân, phôi,… thường được chia thành 4 giai đoạn [Hình 1]:

• Tạo vật liệu khởi đầu
• Tái sinh và nhân nhanh chồi [đôi lúc giai đoạn này được chia nhỏ hơn]
• Ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh
• Huấn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên

Hình 1. Quá trình nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô

Mỗi giai đoạn của nuôi cấy mô đều có những khó khăn, rào cản riêng. Trong đó, giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu đóng vai trò then chốt [input của một quá trình], giúp tạo ra nguồn mẫu sạch cho các thí nghiệm tiếp theo.

Thông thường, cây sống ở ngoài điều kiện tự nhiên thường có các yếu tố như virus, vi khuẩn, nấm, tuyến trùng, côn trùng,… sống bám bề mặt hoặc nội sinh trong mô. Với hầu hết các thí nghiệm, các nhà khoa học đã sử dụng chất sát trùng để khử trùng bề mặt mẫu [Surface sterilization of explants]. Nếu việc khử trùng bề mặt không hiệu quả, nấm, nấm men và vi khuẩn có thể đi vào mẫu nuôi cấy in vitro.

Nguyên nhân là do một số lượng lớn vi khuẩn và nấm hoại sinh trên mô cấy làm giảm hiệu quả khử trùng ban đầu.

Hiệu quả tạo vật liệu khởi đầu phụ thuộc vào đặc điểm mẫu, tuổi mẫu, vị trí lấy mẫu,… ví dụ như vỏ cây sần sùi thì rất khó để khử trùng bề mặt do nó tồn tại nhiều kẽ để mầm bệnh trú ẩn – nơi mà chất sát trùng không chạm tới. Thông thường, mẫu được lấy từ: [1] Mô thực vật tiếp xúc hoặc gần đất; [2] Cây sinh trưởng vùng nhiệt đới trên những cánh đồng thì thường là khó hoặc có khi không thể khử trùng được.

Hầu hết các phòng thí nghiệm sử dụng natri hypochlorite [NaOCl] hoặc canxi hypochlorite [Ca[OCl]2] hoặc chất tẩy trắng thương mại để khử trùng bề mặt. Tác động hoá học của chất tẩy trắng trong gia đình là hypochlorous acid [HOCl], chất mà có khả năng oxi hoá rất mạnh. HOCl không phân ly thành các phân tử trái dấu gấp 100 lần hoạt động chấtkháng sinh hơn sự điện ly hypochlorite [OCl+]. Hoạt động diệt khuẩn của dung dịch hypochlorite phụ thuộc vào pH. Nhiều chất hoá học khác như thuốc kháng sinh, HgCl2, thuốc diệt nấm cũng được sử dụng để khử trùng bề mặt mẫu cấy. Nồng độ và thời gian khử trùng các chất này thì khác nhau và phụ thuộc vào loại và kích thước của mẫu, chúng ta có thể tìm thấy trong nhiều tài liệu. Mặc dù, nhiều tác giả gợi ý rằng chỉ các mô thực vật ở bên ngoài tiếp xúc với hoá chất mới được tẩy độc. Điều đó là hiển nhiên, vì thế sự thành công của việc khử trùng chỉ có thể đạt được nếu mô khử trùng cái mà không tiếp xúc với hoá chất không chứa các yếu tố gây nhiễm.

Có thể thấy sự đột ngột xuất hiện các vi khuẩn gây nhiễm phát triển mạnh ở giai đoạn sau trong nuôi cấy in vitro [sau một vài môi trường hay trong khi bén rễ] chúng được quy là yếu tố gây nhiễm được đi theo nguyên liệu thực vật ban đầu. Nếu nuôi cấy không thể loại bỏ yếu tố gây nhiễm [ví dụ không thể làm sạch cây nguyên liệu ban đầu mà chúng có sẵn yếu tố gây nhiễm hoặc sự nhiễm chỉ được phát hiện khi một số lượng lớn cây được sản xuất]. Tuy nhiên, có thể loại bỏ các yếu tố gây nhiễm bởi sự kết hợp chất kháng sinh vào trong môi trường nuôi cấy. Nhiều tác giả khác nhau đã mô tả những kháng sinh nhạy cảm với vi khuẩn đã làm chúng bị tiêu diệt từ nuôi cấy mô thực vật hoặc có thể thêm chất kháng sinh vào môi trường nuôi cấy để khống chế và loại bỏ vi khuẩn gây nhiễm.

Hình 2. Rệp sống sót [khoanh tròn đỏ] sau khi khử trùng mẫu đốt thân

Hình 3. Đốt thân cây hoa cúc tái sinh chồi, không nhiễm bệnh sau khi khử trùng bề mặt

Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường ĐHSP Hà Nội 2 đã xây dựng quy trình tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô hiệu quả cao đối nhiều loại cây hoa, cây nông nghiệp, cây dược liệu quan trọng.

• Cây hoa: 21 giống hoa cúc thương mại [Chrysanthemum] được trồng phổ biến ở Mê Linh-Hà Nội, 8 giống hoa đồng tiền [loại cao, loại lùn] [Gerbera sp.], 6 giống hoa cẩm chướng [Dianthus caryophyllus],…
• Cây nông nghiệp: cây su su, cây sắn
• Cây dược liệu: cây đinh lăng, cây bìm bịp, cây hoàng tinh hoa đỏ, cây tam thất, sâm Ngọc Linh,…

Để đáp ứng yêu cầu của nền nông nghiệp công nghệ cao trong cuộc cách mạng 4.0 chúng tôi sẵn sàng hợp tác, nhận đặt hàng, chuyển giao với các tổ chức, cá nhân có nhu cầu ứng dụng và phát triển nuôi cấy mô thực vật.

TS. La Việt Hồng - ThS. Ong Xuân Phong

Tags: