Nguyễn Văn Minh82Hình 26: Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp màng lọc.
2. Đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa.
a. Nguyên tắc:
Cấy một thể tích xác định dịch mẫu đã pha loãng lên đĩa petri mơi trường thích hợp.Đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian ni cấy vì mỗi khuẩn là kết quả phát triển của một tế bào.Dùng bút lông kim ghi lên đáy hộp môi trường: tên mẫu, tên người thực hiện, ngày cấy, thể tích dịch cấy, nồng độ pha lỗng.Cách 1 : Dùng pipette vơ khuẩn hút dịch pha loãng cho vào 3đĩa petri môi trường, thể tích bằng nhau, mỗi đĩa có V từ 0,1 ml – 0,5 ml. Lấy que gạt dàn đều mẫu lên mặt thạch để tách riêng từngtế bào.Cách 2 : Dùng pipette vơ khuẩn hút Vml dịch pha lỗng cho vào3 đĩa petri vơ khuẩn, thể tích bằng nhau, mỗi đĩa có V từ 0,1 ml – 0,5 ml. Môi trường pha sẵn trong bình 250ml, bảo quản lạnh.Nguyễn Văn Minh83Đun cách thủy môi trường cho tan đều, chờ nguội 40oC, đổ vào các đĩa chứa mẫu, mỗi đĩa 10 - 15 ml mơi trường. Xoay tròn đĩatheo chiều kim đồng hồ và ngược lại cho môi trường hòa đều mẫu, để n cho mơi trường đặc hoàn toàn.Ở 2 cách trên, mỗi mẫu đều cấy 3 nồng độ liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa petri, sau đó lấy kết quả trung bình.Đặt tất cả các đĩa đã cấy vào tủ ấm, nuôi ở tovà thời gian thích hợp.Dùng bút lông kim và thước, kẻ các ô vuông ở đáy hộp, cạnh ô vuông từ 10 – 15 mm. Đếm số khuẩn lạc trong các ô vuông theolần lượt theo hình zic zắc....1 1i ivd nvd nC mlghayCFU CFUN ++ =∑N: Số tế bào đơn vị hình thành khuẩn vi khuẩn trong 1 g hay 1ml mẫu.Σ C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn.n1: Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ 1.di: Hệ số pha lỗng thứ i.v: thể tích dịch mẫuml cấy vào mỗi đĩa petri.Ø Nguyên tắc: Phương pháp MPN phương pháp có số xác suất cao nhất ; số tối khả còn được gọi là phương pháp pha lỗng tới hạnhay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớnnhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thínghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. ThôngNguyễn Văn Minh84thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.Quy trình thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau : Cho vào các ống nghiệm có chứa mơi trường thíchhợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ phalỗng bậc 10 liên tiếp ví dụ 110, 1100, 11000. Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả biểu kiển chứng minh sựtăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục …, ghinhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mậtđộ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN100ml hay số MPN1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào sốlượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha lỗng. Phương pháp MPN có thể dùng để định lượng bất kỳ loạivi sinh vật nào bằng cách nuôi cấy chúng trên môi trường tăng sinh chọn lọc môi trường lỏng.Ø Thao tác: Cụ thể là đếm Coliforms trong thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạt hoặc nước thải.- Lấy mẫu. - Pha loãng mẫu, chọn ba độ pha lỗng liên tiếp thích hợp.- Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 1 ống nghiệm môi trường Lactose broth.- Ủ ấm từ 35 – 37oC24 – 48giờ. Cách đọc kết quả, tra bảng MPN theo hướng dẫn trên.Nguyễn Văn Minh85Trong phân tích mẫu, nếu khơng đoán được chất lượng vệ sinh của mẫu, ta có thể tăng số dãy kiểm tra lên tùy ý. Nhưngkhi đọc kết quả, ta chỉ đọc 3 dãy liên tiếp nhau.
Phương pháp này có độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp. Có thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di động.
Sau đây là cách đếm khuẩn lạc:
1- Chuẩn bị môi trường
Hòa tan các thành phần môi trường trong nước, phân phối môi trường vào chai thích hợp. Khử trùng ở 121oC 1atm trong 15 phút. Trước khi kiểm tra vi sinh vật cần làm tan chảy hoàn toàn môi trường agar bằng nhiệt [bếp điện hoặc lò viba]
[Lưu ý: Khi môi trường agar tan được 1/3 nên lắc chai môi trường để giúp thoát khí bên trong chai. Khi lắc nên tránh để môi trường chạm vào nút bông]
2 – Cách tiến hành
Mọi việc chuẩn bị và các thao tác bằng tay cần được thực hiện với kỹ thuật vô trùng. Và dùng dụng cụ cần được vô trùng để tránh nhiễm vi sinh vật từ các nguồn bên ngoài vào mẫu.
Đối với các mẫu rắn:
Bước 1:
Cân 25g mẫu vào bình Erlen chứa 225 ml dung dịch pha loãng đã khử trùng để được độ pha loãng 10-1.
[Lưu ý: Sau khi hòa mẫu vào dung dịch pha loãng, nên đồng nhất mẫu trên máy lắc trong 20 – 30 phút trước khi tiếp tục pha loãng nồng độ 10-2]
Bước 2:
Hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ 10-1 lần lượt vào dãy ống nghiệm 9ml để được các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3,10-4,…,10-n tùy theo yêu cầu.
[Lưu ý: Trước khi pha loãng nồng độ tiếp theo nên votex độ pha loãng trước đó để đồng nhất mẫu.]
Bước 3:
Hút 1ml dịch pha loãng ở từng nồng độ cho vào đĩa petri.
[Lưu ý: Nên kiểm tra ở 3 nồng độ pha loãng]
Bước 4:
Thêm vào mỗi đĩa petri khoảng 12 – 15 ml môi trường thạch ở nhiệt độ từ 44 – 47oC. Trộn đều dịch pha loãng với môi trường bằng cách xoay đĩa petri và để hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt các đĩa petri trên bề mặt nằm ngang ở nơi mát.
[Lưu ý: Tránh để môi trường thạch xuất hiện bọt khí khi đổ đĩa]
Sau khi hỗn hợp đông đặc hoàn toàn, lật ngược các đĩa đã chuẩn bị và đặt vào tủ ấm ở [30 ± 1]oC. Ủ trong 48 giờ.
Sau giai đoạn ủ, giữ lại các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 đến 300 khuẩn lạc. Khi đếm khuẩn lạc, chỉ đếm những khuẩn lạc đặc trưng cho chủng vi sinh đang quan tâm, tránh đếm nhầm bọt khí và các hạt không hòa tan trên mặt thạch.
Tính số lượng N vi sinh vật có trong mẫu thử theo trung bình khối lượng từ hai độ pha loãng liên tiếp bằng cách sử dụng Công thức:
Trong đó:
∑C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa được giữ lại từ 2 độ pha loãng liên tiếp. Trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc.
n là số lượng đĩa petri được lựa chọn để tính tổng số khuẩn lạc
V là thể tích mẫu được đưa vào mỗi đĩa, tính bằng ml
d là độ pha loãng tương ứng.
Để mua Môi trường nuôi cấy vi sinh, quý bà con vui lòng liên hệ:
CÔNG TY CỔ PHẦN ĐẦU TƯ THƯƠNG MẠI DỊCH VỤ TIN CẬY
Địa chỉ: Số 4, Đường số 3, Khu Đô Thị Vạn Phúc – Quốc lộ 13, P.Hiệp Bình Phước, Q.Thủ Đức, Tp.HCM
Điện thoại: [028] 2253 3535 – 0165 887 1302 – 0909 307 123 – 0903 908 671
Email: ; ; .
Khuẩn lạc của một loại vi khuẩn được định nghĩa là một cụm [Colony], có thể nhìn thấy được bằng mắt thường, sinh khối của vi khuẩn đó khi chúng phát triển trên bề mặt của một giá thể cứng. Có hai phương pháp đếm khuẩn lạc thủ công và tự động.
Khuẩn lạc là gì?
- Khuẩn lạc là một “tập đoàn” vi khuẩn, một sinh khối của vi khuẩn phát triển trên bề mặt của một giá thể cứng. Trong trường hợp khuẩn lạc phát triển từ 1 tế bào gốc duy nhất, thì bộ gen của chúng đều giống nhau y hệt, và chúng được gọi là một dòng.
- Hay hiểu một cách đơn giản, khi chúng ta nuôi cấy 1 loại vi khuẩn nào đó trong môi trường thuận lợi, chúng sẽ sinh trưởng và phát triển thành một “tập đoàn” các vi khuẩn có thể quan sát được bằng mắt, đó là “khuẩn lạc”.
- Chúng ta phân loại các loại khuẩn lạc dựa vào: Môi trường nuôi cấy, màu sắc và hình dạng khuẩn lạc…
Cách đếm khuẩn lạc trên đĩa petri
- Cách xác định khuẩn lạc trên đĩa petri phổ biến và cổ điển chính là pha loãng mẫu vật, sau đó cấy trên đĩa petri hay còn gọi là đĩa thạch. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc trên đó.
Cách đếm khuẩn lạc thủ công
- Đầu tiên, chúng ta cần chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Hòa tan các thành phần môi trường trong nước. Khử trùng ở 121oC và 1atm trong 15 phút. Trước khi đếm khuẩn lạc cần làm tan chảy hoàn toàn môi trường agar trên bếp điện hoặc lò vi sóng.
- Yêu cầu cần đáp ứng: Công việc chuẩn bị cũng như các thao tác phải thực hiện trong môi trường vô trùng. Các dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hiện cũng cần được tiệt trùng, tránh sai sót trong khi đếm khuẩn lạc.
Phương pháp đếm khuẩn lạc
- Một trong những cách cổ điển để xác định mật độ vi sinh vật trong một mẫu là pha loãng mẫu, cấy lên đĩa thạch và sau đó đếm các khuẩn lạc mọc trên đó. Vi khuẩn được cấy trên đĩa phát triển hình thành các khuẩn lạc từ một hoặc một số vi khuẩn ban đầu. Những khuẩn lạc này có thể được thấy và đếm bằng mắt thường hoặc kính hiển vi. Số lượng khuẩn lạc được sử dụng để xác định và đếm vi khuẩn trong mẫu đất, nước và thực phẩm.
- Pha loãng mẫu, cấy và ủ
- Nếu bạn chỉ tạo một vệt mẫu vi sinh đơn giản trên đĩa thạch, sẽ có rất nhiều khuẩn lạc riêng rẽ mọc chồng lấn lên nhau khiến không thể đếm được số lượng khuẩn lạc. Để giải quyết vấn đề này, trộn mẫu với dung dịch, lấy một lượng nhỏ hỗn dịch mẫu ban đầu này để tiếp tục pha loãng nó. Lặp lại quy trình này 6 tới 10 lần. Chải đều dung dịch pha loãng cuối cùng lên đĩa thạch và ủ nó từ bốn tới bảy ngày trước khi đếm khuẩn lạc phát triển trên đó.
Phương pháp đếm khuẩn lạc thủ công
- Cách thức trong phương pháp đếm khuẩn lạc là đếm mỗi chấm khuẩn lạc một lần. Một cách tiếp cận là đặt đĩa petri lên một lưới ô và đếm các khuẩn lạc trong mỗi ô. Đánh dấu khuẩn lạc đếm được ở đằng sau của đĩa petri cũng là một cách hữu ích. Nhìn chung, bạn sẽ cần đếm ít nhất ba đĩa; chỉ khi sử dụng đĩa chứa 30 tới 300 khuẩn lạc để giúp đưa ra kết luận tin cậy. Các đĩa mà quá nhiều hoặc quá ít khuẩn lạc đều không thích hợp và cần pha loãng và cấy lại mẫu.
Phương pháp đếm khuẩn lạc tự động
- Đếm khuẩn lạc thủ công mất rất nhiều thời gian và có thể nhầm lẫn do lỗi chủ quan của người thực hiện. Để cải thiện điều này có thể sử dụng các thiết bị đếm khuẩn lạc tự động. Máy đếm khuẩn sẽ chụp một ảnh của đĩa, tách các khuẩn lạc khỏi nền và sau đó sử dụng một thuật toán để đếm các khuẩn lạc trên đĩa. Thuật toán có thể gặp có khăn trong việc phân biệt các khuẩn lạc khi hai hoặc nhiều khuẩn lạc chồng lấn ở vùng rìa, bởi vậy đây là một lĩnh vực của sự phát triển phần mềm hiện tại.
Hạn chế của phương pháp đếm khuẩn lạc
- Độ chính xác của việc tính mật độ vi khuẩn từ số khuẩn lạc thực sự có một số hạn chế. Các đơn vị hình thành khuẩn lạc có thể là một tế bào đơn, một chuỗi tế bào hoặc cả một cụm tế bào. Giả thiết rằng một khuẩn lạc đại diện cho một tế bào, như vậy mật độ tính toán được có thể thấp. Các vi khuẩn khác nhau cần các điều kiện sinh trưởng khác nhau, và khuẩn lạc trên đĩa chỉ thể hiện những vi khuẩn mà phát triển trên môi trường cấy dưới những điều kiện ủ đó. Hơn nữa, đếm khuẩn lạc không tính được tế bào chết, cần phải cân nhắc kỹ khi bạn cần mật độ tế bào trong mẫu ban đầu.
Thế nào là máy đếm khuẩn lạc?
- Máy đếm khuẩn lạc dùng để xác định các loại vi sinh vật sống trong mẫu và mật độ vi sinh vật trong đĩa mẫu
- Máy đếm khuẩn lạc có 2 cấu hình cơ bản
+ Máy đếm khuẩn lạc thủ công: Được cấu tao bởi một bàn với đèn nền, chia vạch , kính lúp 10X giúp phóng đại mẫu,1 bút đếm và màn hình đếm, phím tăng/giảm giá trị
+ Máy đếm khuẩn lạc tự động: Gồm 1 hệ thống quét tự động, kết nối với phần mềm trên máy tính PC cho kết quả nhanh với độ chính xác cao.