Aflp là gì

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NC VÀ PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI BÁO CÁO
MÔN: DI TRUYỀN PHÂN TỬ
KỸ THUẬT AFLP
[Amplified Fragments Length Polymorphism]
Người hướng dẫn
Gs.Ts. NGUYỄN THỊ LANG
Viện lúa ĐBSCL
Tháng
10/2015
Tháng
10/2015
PHẦN MỞ ĐẦU
Công tác lai tạo giống theo phương pháp truyền thống có hệ số nhân chậm
và có nhiều trở ngại vì cơ chế sinh học sinh sản của giống cây trồng và vật nuôi rất
phức tạp. Kiểm soát một số tính trạng của các giống này làm tiêu tốn nhiều thời
gian, chi phí cho chương trình lai tạo giống. Hơn nữa, nhà đầu tư quan tâm nhiều
đến các tính trạng liên quan đến số lượng hơn là chất lượng. Gần đây, nhờ sự phát
triển của sinh học phân tử cùng với sự hỗ trợ của marker chọn lọc cho phép phát
triển những qui trình dựa trên kiểu gen [không chịu ảnh hưởng khi điều kiện môi
trường biến đổi] hơn là chọn lọc dựa trên kiểu hình như phép chọn lọc truyền
thống vẫn thực hiện. Bằng kỹ thuật AFLP [amplified fragment length
polymorphism], một phương pháp có hiệu quả để nhân dòng và giải trình tự những
marker liên kết này để xác định đặc điểm của chúng.
AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được
toàn bộ gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước
trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài
[các mồi thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài].
PHẦN NỘI DUNG

A. GIỚI THIỆU
I. KỸ THUẬT AFLP
1. Khái quát
Về căn bản, bất cứ một chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai
cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau, đều được xem như là một DNA
marker. DNA marker được chia làm bốn nhóm như sau:
-PCR based [ ALP, AFLP, SSR, SSCP, STS].
-DNA- không phải là PCR base như: DNA/DNA hybrybization: RFLP
minysatellite. RFLP thường có hệ di truyền là Dominant.
-Genomic base: Thí dụ SNP dùng để tách các vùng đột biến.
-Protein base và proteomic: các marker chia ra 3 kiểu.
+ Isozyme là enzyme marker
+ Protein dự trữ
+ PTLs protein quantitative luci: protein thể hiện như là marker và như là các
tính trạng trong bản đồ.
Tùy theo tính chất của genomic mà chúng ta có thể áp dụng các marker để
khai thác da dạng hóa nguồn gen phát hiện gen, xây dựng bản đồ gen.
Trong các marker trên kỹ thuật AFLP thuộc nhóm PCR based được hiểu là sự
đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2
enzyme giới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng
khuếch đại PCR. AFLP là một trong những kỹ thuật in dấu DNA [DNA
fingerprinting] được phát triển bởi Vos và cộng sự năm 1995.
Fingerprinting đã và đang được phát triển khá thành công với hai hướng chiến
lược nghiên cứu như sau :
- Fingerprinting trên cơ sở lai, có tính chất kinh điển: Bao gồm kỹ thuật cắt
DNA, kỹ thuật điện di, RFLP được phát hiện bởi kỹ thuật lai với probe thông qua
xét nghiệm Southern.
- Fingerprinting trên cơ sở PCR: Bao gồm kỹ thuật khuếch đại DNA in vitro
bằng primer đặc biệt hay primer ngẫu nhiên.
Kỹ thuật AFLP là một công cụ hữu ích để xác nhận nhiều loại của đa hình

DNA mà không cần phải biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng
[Michelmore và ctv., 1998], phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ước
lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa những quần thể với nhau [Breyen và
ctv., 1997; Cervera và ctv.,1996].
Nghiên cứu đa hình của DNA nhờ AFLP là mô hình mẫu trong nghiên cứu di
truyền Menden, do đó nó có thể được dùng trong việc xây dựng bản đồ gen của
các sinh vật, trong đó có con người để chẩn đoán và chữa trị các bệnh di truyền,
cũng như tạo ra ngân hàng gen phục vụ lợi ích cho con người.
2. Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp AFLP là dựa trên độ đặc hiệu của các enzym
cắt giới hạn [restriction enzym RE] đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA
bộ gen. Sự khác biệt vị trí giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.
Kỹ thuật AFLP gồm hai nội dung cơ bản là:
- Cắt DNA bằng enzyme giới hạn có bổ sung các adaptor đặc hiệu tạo nên
các đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho các mồi đã chọn trước. Cặp enzyme thường
được dùng nhất là EcoRI - MseI. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị
trí cắt enzyme. Khi sử dụng chúng chung với nhau, những enzym này sẽ tạo ra những đoạn DNA rất ngắn,
chúng được khuếch đại khá tốt, và đạt được kích thước tối hảo [250
6 60- 250
8 40- 120
10 20-60
12 10-50
Tuy gel acrylamide đắt và độc hơn so với gel agarose nhưng nó có những
ưu điểm nổi bật so vớ gel agarose: Khả năng phân tách rất tốt, có thể phân tách
được những đoạn DNA chỉ khác nhau 1bp. Chạy được với điện áp cao nên tiết
kiệm được thời gian.
- Hiệu điện thế và cường độ dòng điện.
- Quan hệ giữa hiệu điện thế và chiều dài gel: Để tạo ra một điện trường cần phải
có một hiêu điện thế. Hiệu điện thế được tính bằng tích của điện trường với chiều
dài phân tách. Như vậy, gel càng dài thì hiệu điện thế sử dụng càng phải lớn để tạo
ra được một điện trường nhất định trên toàn bộ bản gel.
- Nhiệt độ đối với quá trình điện di: Quá trình điện di sẽ sinh ra năng lượng mà
hầu hêt năng lượng này chuyển thành nhiệt năng. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự
phân tách các sơi DNA trên gel PA biến tính trong khoảng 50
0

C. Nhiệt độ này
được điều khiển bằng việc tăng giảm các giá trị hiệu điện thế và công suất khi điện
di.
* Thành phần dung dịch đệm điện di:
Sự di chuyển của DNA trong điện trường bị ảnh hưởng bởi thành phần và
lực ion của đệm điện di. Có một vài loài đệm khác nhau dùng cho điện di DNA
như TAE, TPE, TBE. Những đệm này có chứa EDTA pH=8 với Tris- acetat
[TAE], Tris- borate[TBE] hoặc Tris- Photphat [đệm TPE] có nộng độ xấp xỉ 50ml
[pH =7.5-7.8]. Hiện nay thì đệm TBE được sử dụng rộng rãi hơn cả vì sự ổn định
về thành phần của nó.
* Phân tích sản phẩm AFLP: sau PCR, một thể tích formamide dye được thêm
vào phản ứng. Mẫu được biến tính bằng nhiệt ở 95
0
C trong 3 phút và đặt ngay vào
đá. Sản phẩm AFLP được điện di trên gel polyacrylamide biến tính [19:1
acrylamide: bisacrylamide; 7,5 M urea; 0,5 X TBE buffer ]. Bản gel được cố định
trong axit axêtic 10%, nhuộm trong bạc nitrat 1%, hiện trong natricacbônat 2,5%
và cố định lại trong axit axêtic 10%.
C. MỘT ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT AFLP
Cá tra [Pangasius hypophthalmus] là loài cá có giá trị kinh tế cao và được
nuôi trồng phổ biến ở khu vực Đông nam Á. Ở Việt Nam, cá tra được nuôi nhiều ở
các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Thời gian gần đây, cá được di giống thuần
hoá nuôi ở một số tỉnh phía Bắc. Cá thương phẩm có giá trị trên thị trường cả
trong và ngoài nước. Hiện cả nước có trên 14 doanh nghiệp xuất khẩu cá tra, ba sa
với kim ngạch hàng năm trên 60 triệu USD. Nâng cao hiệu suất nuôi trồng để tăng
lợi nhuận luôn là mục tiêu của các nhà sản xuất. Bên cạnh những nghiên cứu nhằm
tăng hiệu quả sinh sản, dinh dưỡng, việc cải tạo giống để tạo những dòng cá có
năng suất cao được chú trọng. Chương trình lai tạo, chọn giống truyền thống luôn
đóng vai trò chủ đạo trong cải tạo giống. Nhờ vào kỹ thuật cho phép tuyển chọn
đồng thời trên toàn bộ hệ gen và tạo ra một số lượng lớn chỉ thị có thể chuyển đổi

thành chỉ thị đặc hiệu vị trí đơn giản [simple locus-specific markers] mà không
cần biết trước thông tin của trình tự đặc hiệu đó.
Phát triển chỉ thị AFLP liên quan tính trạng quan tâm có thể dựa trên sự
phân bố ngoại hình của hai quần thể đối lập nhau hoặc dựa trên đa hình di truyền ở
hai nhóm cá thể đối lập nhau. Phương pháp này có ưu điểm không cần thiết lập
bản đồ di truyền và tạo ra các phả hệ đặc biệt, nên thích hợp cho phát hiện vị trí
tính trạng định lượng [QTL] trực tiếp từ các quần đàn thương phẩm có tuổi thành
thục dài như cá tra [2-3 năm]. Với mục đích phát triển chỉ thị AFLP trực tiếp từ
quần đàn thương phẩm, phân tích đa hình AFLP giữa hai nhóm cá tra có trọng
lượng cực lớn và cực nhỏ.
Đa hình AFLP giữa nhóm cá lớn và nhóm cá nhỏ của tổ hợp mồi E-ACA/M-
CAG. [ 1,2: Băng AFLP xuất hiện ở cả 2 nhóm cá với tần số khác nhau]
Tổng cộng có 204 băng AFLP được tạo ra từ 43 tổ hợp mồi, trung bình là
4,74 băng AFLP/mồi. Tần suất xuất hiện các băng AFLP ở hai nhóm cá tra là khác
nhau nên chúng tôi đã tính tần số khác biệt giữa hai nhóm. Kết quả được thể hiện
ở bảng 2.
Bảng 2: Tần số khác biệt của các băng AFLP giữa hai nhóm cá tra
Những băng AFLP có tần số khác biệt trên 50% được thể hiện ở bảng 3.
Bảng 3: Các băng AFLP có tần số khác biệt trên 50 %.
Kết quả trên cho thấy, chỉ có 8 băng AFLP có tần số khác biệt trên 50%,
chiếm 3,92% tổng số băng AFLP. Để kiểm tra mức độ ổn định và tin cậy của các
băng AFLP, người ta đã tiến hành phân tích các băng AFLP này với số lượng mẫu
lớn hơn [18 mẫu]. Kết quả cho thấy, băng AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT
và băng AF 7-4 của tổ hợp mồi E- ACC/M-CAA đạt độ chênh lệch giữa 2 nhóm
cá thí nghiệm là 56% và 50%. Do có tính ổn định tương đối, rõ nét và ưu thế cho
nhóm cá có trọng lượng nhỏ, hai băng AFLP này được tách dòng và đọc trình tự
nhằm mục đích xây dựng 2 chỉ thị AFLP liên quan tới tính trạng tăng trưởng của
cá tra.
Phân tích đa hình AFLP cá tra bằng 54 tổ hợp mồi chọn lọc cho thấy tỷ lệ
đa hình trong loài tương đối thấp, trung bình 1,35%. Tuy nhiên, tỷ lệ này đủ tin

cậy trong việc xác định các chỉ thị liên quan tính trạng có ý nghĩa kinh tế.
So sánh đa hình AFLP giữa 2 nhóm cá tra có trọng lượng 2 cực cho thấy 8 băng
AFLP có tần số khác biệt trên 50%. Tuy nhiên chỉ có 2 băng: AF 7-4 của tổ hợp
mồi E-ACC/M- CAA và AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT có tính ổn định,
và vẫn giữ được tỷ lệ này khi kiểm tra trên số lượng mẫu lớn hơn. Hai băng này sẽ
được sử dụng để tuyển chọn lại trong quần đàn.
Nguyễn Thu Thuý, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn Văn Cường
Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
PHẦN KẾT LUẬN
Marker phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và cải tiến di
truyền ở nhiều loại cây trồng và vật nuôi. Nhờ markers phân tử chúng ta có thể
đánh giá được sự đa dạng sinh học, xây dựng lại phả hệ và hiểu cấu trúc, sự tiến
hóa và mối quan hệ giữa các cá thể trong quần thể cây trồng. Hệ thống marker
phân tử cho biết sự biến thiên về trật tự ADN trong hệ genome. Trên thế giới, các
nghiên cứu về di truyền đã sử dụng nhiều loại marker khác nhau như RFLP,
RAPD, SSR và ISSR, trong đó có AFLP.
AFLP là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP
và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, dùng những phân
đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân
biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen. Sự khác nhau
trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong
vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt. AFLP nhanh, đơn
giản, không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen. Kỹ thuật
này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại
phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài [các mồi thương mại có
thể dùng cho hầu hết các loài]. Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm
hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp.
AFLP được sử dụng trong việc xác định tính đa hình giữa các các giống
loài, lập bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so với những marker khác [Vos và
ctv., 1995], tạo nhóm liên kết di truyền giữa các giống, đánh giá mức độ liên hệ di

truyền hoặc sự khác nhau giữa các giống, là công cụ hiệu quả để phát hiện tính
chất đa hình nên dễ dàng nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể. Đồng thời thông
tin di truyền từ các vật liệu nghiên cứu sẽ góp phần giúp định hướng cho các phép
lai trong công tác chọn giống.